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发酵上游:构建基因工程菌

时间:2019/9/29 16:35:22 点击:

  核心提示:基因工程的发展为人类快速获取一些高效菌种提供了新方法。微生物学家发现微生物对污染物的降解性与其所带的质粒有关。利用降解性质粒的相容性,把能够降解不同有害物的质粒组合到一个菌种中,组建一个多质粒的新菌种...
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基因工程的发展为人类快速获取一些高效菌种提供了新方法。微生物学家发现微生物对污染物的降解性与其所带的质粒有关。利用降解性质粒的相容性,把能够降解不同有害物的质粒组合到一个菌种中,组建一个多质粒的新菌种,这样能使一种微生物降解多种污染物或完成降解过程的多个环节,或使不带降解性的菌带上质粒从而获得降解性。另外,可采用质粒分子育种,即在选择压力的条件下培养,使微生物发生质粒相互作用和传递,缩短了自然进化所需的时间,以达到加速培养新菌种的目的。降解性质粒DNA体外重组,是在体外对生物大分子DNA进行剪切加工,将不同亲本的DNA重新连接,转移到受体细胞中,通过复制表达使细胞获得新的遗传性状。原生质体融合技术,同样会使细胞获得多个不同亲本的性状。基因工程的基本操作如下。

    (1)目的基因的获得  在进行基因工程操作时,首先必须取得有实际意义的目的基因,一般有3条途径:①从适当的供体细胞(各种动植物及微生物均可选用)的DNA中分离;②通过反转录酶的作用由mRNA合成cDNA(complementarv DNA,互补DNA);③由化学方法合成特定结构的基因。

    (2)载体的选择有了目的基因后,还必须有符合要求的运送目的基因的载体,以便把它运载到受体细胞中进行增殖和表达。载体必须具备以下条件:①是一个有自我复制能力的复制子;②能在受体细胞内大量增殖,即有较高的复制率;③载体上最好只有一个限制性内切核酸酶的切口,使目的基因能固定地整合到载体DNA的一定位置上;④载体上必须有一种选择性遗传标记,以便及时把极少数“工程菌”或“工程细胞”选择出来。

    作为原核受体细胞的载体,主要有细菌质粒和λ噬菌体两类。真核受体细胞的载体,主要有SV40病毒。在正常情况下,SV40是在猴体内繁殖的小型ds DNA病毒,也能感染人和许多动物细胞。对植物细胞来说,其载体主要是Ti质粒。

    (3)目的基因与载体DNA的体外重组  在体外,将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制并且具有选择性标记的载体分子上,形成重组DNA分子。

    采用限制性核酸内切酶的处理或人为地使参加重组的两个DNA分子产生互补黏性末端。由于每一种限制性核酸内切酶所切断的双链DNA片段的黏性末端有相同的核苷酸组分,所以当两者相混时,凡黏性末端上碱基互补的片段.就会因氢键的作用而彼此吸引,重新形成双链。这时,在外界连接酶的作用下.供体的目的基因就与载体的DNA片段形成共价结合,成为一个完整的有复制能力的环状重组载体——嵌合体(chimaera)。

    (4)重组载体引入受体细胞上述在体外反应生成的重组载体,只有将其引入受体细胞后,才能使其基因扩增和表达。在所有受体细胞中,目前使用最广泛的是大肠杆菌(E.coli),枯草杆菌和酿酒酵母也正被越来越多地用作基因工程中的受体。

    在理想情况下,上述重组载体进入受体细胞后,这一细胞就成了“工程菌”。

    (5)筛选优良菌种  从大量细胞繁殖群体中,筛选获得重组DNA分子的受体细胞克隆,并对这些筛选出来的受体细胞克隆进行性能的测定和鉴定。


作者:不详 来源:网络
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