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粪肠球菌HX-3细胞转化合成γ-氨基丁酸条件的优化

时间:2015/11/9 14:43:37 点击:

  核心提示:[1]粪肠球菌HX-3细胞转化合成γ-氨基丁酸条件的优化黄祖耀,薛正莲*,陈涛 (安徽工程大学生物与化学工程学院,微生物发酵安徽省工程技术研究中心,安徽 芜湖 241000)摘 要:本文采用粪肠球菌H...

[1]粪肠球菌HX-3细胞转化合成γ-氨基丁酸条件的优化

黄祖耀,薛正莲*,陈涛

(安徽工程大学生物与化学工程学院,

微生物发酵安徽省工程技术研究中心,安徽 芜湖 241000)

摘 要本文采用粪肠球菌HX-3菌体细胞转化法制备γ-氨基丁酸(GABA)并对影响细胞转化反应的一系列条件进行了正交优化。结果表明,在优化后的转化条件下,即:发酵2 d的菌体细胞、温度42 、缓冲液pH 4.8PLP浓度0.05 mmol/L、谷氨酸钠35 g/L,进行转化反应体系中GABA浓度可达9.14 g/L

关键词粪肠球菌;γ-氨基丁酸;细胞转化;正交

 

Optimization of Biotransformation conditions for γ-aminobutyric acid production by Enterococcus faecalis HX-3 cells

HUANG Zu-yao  XUE Zheng-lian*  CHEN Tao

(Institute of Biologic & Chemical Engineering of Anhui Polytechnic University, Microorganism fermentation engineering and technology research center of anhui province, Wuhu , Anhui 241000,China)

Abstract: In this paper, γ-aminobutyric acid(GABA) was prepared by biotransformation method through Enterococcus faecalis HX-3 cells, meantime, conditions of affected cells conversion reaction were optimizated by orthogonal experiment. The results showed that the optimum transformation conditions were: fermentation of bacterial cells in 2 d, temperature 42 °C, buffer of pH 4.8, PLP concentration of 0.05 mmol/L and sodium glutamate 35 g/L, and in the conversion reaction conditions, GABA concentration in the system can be up to 9.14 g / L.

Key words: Enterococcus faecalis; γ-aminobutyric acid; Biotransformation; Orthogonal

 

 

 

γ-氨基丁酸(GABA)又名氨酪酸,是一种在动植物体内起神经镇定作用的非蛋白质氨基酸,主要是由谷氨酸经过谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase, GAD)脱羧形成。GAD是一种吡哆醛类裂解酶,能专一地催化L-谷氨酸脱羧生成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyrate, GABA)CO2,是原核和真核生物的细胞中广泛存在的一种酶。细菌中,GABA的合成和分泌是细菌抵抗极端酸性pH环境的主要机制。植物中,GABA的合成与植物生长的逆境生理密切相关。动物体内,GABA是中枢神经系统主要的抑制性神经递质。人体内的GAD不仅与自身免疫性疾病I型糖尿病的发病机制密切相关,而且其催化产物GABA还具有降血压、抗惊厥、营养神经细胞、促进生长素分泌、健肝利肾、改善更年期综合症、改善人类脑衰老机能等多种保健功效[1-2]。国外学者已从米曲霉[3]、大肠杆菌[4]、人、植物中克隆了编码GAD的基因序列,正在应用GAD基因工程技术开发富含GABA的功能食品和预防I型糖尿病的治疗食品[5-6]。由于GAD广泛分布于生物界,并且催化相同的化学反应,它在生物学中的普遍意义已经受到重视。国内研究者近几年对生物发酵制备GABA做了大量研究[7-8]。并对生物材料中GAD的分离纯化和GABA饲料添加剂和功能食品的研究开发比较关注[9-11]

本文采用菌体细胞转化法制备GABA,对谷氨酸脱羧酶的酶活进行描述,并对生物转化条件进行了研究,探讨了包括底物浓度、转化温度、缓冲体系pH以及磷酸吡哆醛(PLP)的作用浓度在转化过程中对GABA产量的影响。以期为使用食品安全级微生物乳酸菌的谷氨酸脱羧酶来催化合成GABA 提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验菌种:乳酸菌株HX-3,实验室分离纯化,经过生理生化与分子生物学鉴定为乳酸菌大类、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(GeneBank号:JN990826

1.2 培养基

MRS 种子培养基:蛋白胨1%、酵母提取物1%、葡萄糖0.5%、乙酸钠0.5%、磷酸氢二钾0.02%、柠檬酸三胺0.02%、硫酸镁0.02%、硫酸锰0.005%、吐温-80 0.1 mL/LpH 6.5115 ,灭菌25 min

TYG 液体培养基:胰蛋白胨0.5%、酵母提取物0.5%、葡萄糖1%、丁二酸钠0.5%、加入一定量的谷氨酸钠,pH 6.5115 ,灭菌25 min

1.3 Enterococcus faecalis HX-3细胞转化制备GABA

将固体斜面培养基上菌种进行菌种传代与活化,菌种在MRS 液体培养基中30 富集24 h。然后取富集液按10% 接种量加至TYG 液体培养基中30 静置培养。取培养好的发酵液10mL离心(4000 r/min10 min) ,收集菌体,用0.2 mol /L 磷酸盐缓冲液(pH7.2)充分洗涤,调节pH7.0,再离心得到菌体细胞备用。

0.2 mol/L 的醋酸-醋酸钠的缓冲液pH4.7 (内含30 g/L谷氨酸钠、0.1 mmol /LPLP(分子量265)为底物溶液,加入制得菌体细胞,再加入1%的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。30 180 r/min搅拌反应一定时间,离心过滤后测定GABA的含量。在上述测定条件下,每h产生1 μmol GABA所需的酶量定义为1个酶活力单位(U),以相对酶活(U/g菌体)比较在不同条件下菌体细胞GAD活力大小。

酶活计算公式

U= C*V*103/( Mr *t)

其中:

                            UGAD酶活力,U

          C-酶反应产生GABA的浓度,g/L

V-酶反应体积,mL

     t-测定酶活时的反应时间,h

MrGABA的相对分子质量。

1.4 不同时间发酵液中GABA浓度与酶活力关系

分别在不同时间取样,制备转化反应所需菌体细胞,并同时测定发酵液中GABA的浓度,探索酶活力与发酵液中GABA浓度之间的关系。

1.5 底物浓度在转化过程中对谷氨酸脱羧酶的影响

配制10 g/L20 g/L30 g/L40 g/L50 g/L谷氨酸钠做底物进行细胞转化反应,确定底物浓度在转化过程中对酶活力的影响。

1.6 PLP浓度在转化过程中对谷氨酸脱羧酶的影响

在谷氨酸脱羧酶作用底物生成GABA的过程中,PLP辅酶的浓度对酶活有一定的影响。在转化反应过程中分别控制PLP辅酶的工作浓度为0 mmol/L0.1 mmol/L0.2 mmol/L0.3 mmol/L0.4 mmol/L。测定PLP浓度对转化制备GABA的影响。

1.7 pH对转化过程中谷氨酸脱羧酶的影响

配制不同pH浓度梯度的醋酸-醋酸钠缓冲液,pH分别为3.84.24.65.05.45.8,测定转化反应在不同pH梯度的缓冲体系下GABA浓度。

1.8 温度对转化过程中谷氨酸脱羧酶的影响

30 35 40 45 50 下进行菌体细胞转化反应,反应结束后测定GABA含量。确定不同温度对转化制备GABA的影响。

1.9正交试验设计

对上述所选因素进行正交试验设计,利用正交试验中的L934)正交表进行实验。各因素与水平取值表如表1所示。

1 因素水平取值表

   因素

水平         

底物浓度     PLP浓度     pH     温度

g/L     mmol/L           ()

1

2

3

     25          0.05        4.4      42

30          0.1         4.6      45

35          0.15        4.8      48

 

2 结果与分析

2.1不同时间发酵液中GABA浓度与酶活力关系

1 发酵液中GABA浓度与酶活关系

Fig.1 The relationship between GABA concentration and enzyme activity

由图1可以看出,在整个发酵过程中,GABA的浓度在逐渐积累,并在发酵3 d达到最大值。谷氨酸脱羧酶的活力变化明显,在2 d时,酶活力最大。以后酶活力明显下降,可能是因为产物积累抑制酶活力。所以在转化制备GABA时取发酵培养2 d的菌体细胞酶活力较高。

2.2 转化过程中底物浓度对GABA浓度的影响

2 底物浓度对转化生成GABA的影响

Fig.2 The influence of GABA production on substrate concentration

在转化反应中,起始底物质量浓度对酶活有着较为明显的影响。从而影响GABA的产量,由图2可以看出随着底物浓度的增加转化率随之增加。底物浓度30 g/L时,体系中GABA浓度最高,当底物浓度继续增加时转化率不再随转化时间延长而增加,出现了酶活的急剧下降可能是由于产物抑制作用造成。

2.3 转化过程中PLP浓度对GABA浓度的影响

3 PLP浓度对转化生成GABA的影响

Fig.3 The influence of GABA production on PLP concentration

谷氨酸脱羧酶是一种吡哆醛类裂解酶,PLPGAD不可缺少的辅酶,底物进入细胞后与PLP形成席夫碱,这种中间体是GAD作用的直接底物[12-13],因此我们假设在反应体系中添加PLP会影响GABA的产量。在缓冲液中添加了不同浓度的辅酶后,由图3可以发现外源PLP可以显著提高GABA的产量,这可能是因为外源PLP会抑制酶自身结合辅酶的脱落。当PLP浓度达到0.1 mmol/L时,GABA浓度达到最高值。

2.4 转化过程中转化pHGABA浓度的影响

4 缓冲体系pH对转化生成GABA的影响

Fig.4 The influence of GABA production on pH

酶蛋白分子上有许多酸性、碱性的侧链基团,pH的改变可影响酶分子活性部位的解离状态,从而影响酶的活性。由图4得出谷氨酸脱羧酶在酸性范围内具有较高酶活,当pH 达到5.0以后,酶活迅速降低,可以看出在转化pH4.6时转化体系中GABA浓度最高。

2.5 转化过程中转化温度对GABA浓度的影响

5 转化温度对转化生成GABA的影响

Fig.5 The influence of GABA production on temperature

温度是影响酶活的一个重要因素,低温下酶活不能完全表现,且影响转化反应中底物与产物的跨膜运输,而过高的温度又会使酶蛋白变性,丧失酶活。由图 5可知,酶在4045 范围内都有较高活力,最适温度在45 。在此温度下转化体系中GABA浓度最高。

2.6 正交试验结果分析

按照表中的各因素及水平取值做9次实验,每个实验做2组平行,正交试验结果的极差分析与方差分析结果如下表2、表3所示。

2 正交实验结果及极差分析结果

试验号    底物浓度    PLP浓度      pH        温度    GABA浓度

g/L    mmol/L                ()     g/L

1          1           1           1          1       7.46

2          1           2           2          2       4.87

3          1           3           3          3       6.55

4          2           1           2          3       7.80

5          2           2           3          1       5.07

6          2           3           1          2       5.49

7          3           1           3          2       8.54

8          3           2           1          3       5.20

9          3           3           2          1       7.07

K1            6.29         7.93        6.05        6.53

K2            6.12         5.05        6.58        6.30

K3            6.94         6.37        6.72        6.52

R         0.82         2.88        0.67        0.23

3  正交实验方差分析

方差来源   自由度   平方和    均方     F     Pr>F     显著性

底物浓度     2      2.231    1.116     7.324    0.016        *

PLP浓度     2      25.117   12.559    82.441   0.000        **

pH        2     1.491     0.745     4.893   0.041         *

温度       2     0.201     0.100     0.659    0.543      

模型       9     29.103    3.234     21.227   0.000        **

重复组     1     0.062     0.062     0.410    0.540

误差       8     1.219     0.152

总和      18     778.135

R-square             96.00%

Adjusted R-square      91.50%

(注:标*表示P<0.05,为显著影响;标**表示P<0.01为极显著影响)

综上所述,正交试验的4个因素的极差分析表可以看出,4个因素对转化过程中GABA浓度的影响程度为: PLP浓度>底物浓度> pH >温度,由方差分析结果中R2=96.00%,可知该模型的线性关系较好,可信度较高。条件PLP浓度P<0.01对实验结果有极显著影响,底物浓度、pH P<0.05对实验结果有显著影响,温度对实验结果没有显著影响,依实验方便而定。所以最终得出正交试验得出最优组合水平的选取为: PLP浓度取1水平、底物浓度取3水平、pH3水平、温度取1水平。由于这个条件不在这9次试验中,补做此验证性实验,三组平行。在此条件下GABA含量均值9.14 g/L,高于7号实验,所以底物浓度35 g/L、温度42 pH 4.8PLP浓度0.05 mmol /L,为转化实验最优组合。通过对转化实验最优组合的摸索,为后期乳酸菌细胞转化生产GABA的生产能力测试提供一定的理论基础。

3 结论

粪肠球菌是人和动物肠道中的常见菌种,用于发酵食品或作为益生菌添加于动物饲料,预防畜肠道疾病和改善动物生长。本文报道了1株来源于发酵食品的产GABAHX-3菌株,可作为开发富GABA 食品和动物饲料益生菌的菌种,具有较好的应用前景。采用HX-3细胞转化反应制备GABA,通过对各影响因素的考察,确立了最优转化体系组成:发酵2 d的菌体细胞,PLP浓度0.05 mmol/LL-谷氨酸钠35 g/L,于pH 4.8、温度42 180 r/min搅拌反应后,转化液GABA 的浓度可达9.14 g/L

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[1]作者简介:黄祖耀(1986~),男,硕士研究生。研究方向工业微生物育种

*通讯作者:Tel:0553-2871254, E-mail: xuezhen0851@sina.com

 

作者:黄祖耀,薛正莲*,陈涛 来源:网络
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