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葛姜复合饮品的毒理学初步评价

时间:2015/11/5 16:11:06 点击:

  核心提示:葛姜复合饮品的毒理学初步评价李生1,谢美玉2,*,于珊3(1.吉林工商学院,吉林长春130507;2.长春工业大学化学与生命科学学院,吉林长春130012;3.康美药物研究院有限公司,北京100000...
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葛姜复合饮品的毒理学初步评价

李生1谢美玉2,*,于珊3

 (1.吉林工商学院,吉林长春1305072.长春工业大学化学与生命科学学院,吉林长春1300123.康美药物研究院有限公司,北京100000)

摘要:葛姜复合饮品是由葛根、姜黄、枳椇子、甘草、五味子辅以木糖醇和对羟基苯甲酸乙酯而研制的一款对酒精性肝损伤有辅助保护作用的保健食品。为判定其对人体健康是否产生危害,本试验进行了毒理学评价。根据《保健食品检验与评价技术规范实施手册》对该饮品进行了急性毒性和遗传毒性试验,其中遗传毒性试验包括:Amese实验、微核试验和精子畸形试验。结果表明:急性毒性试验未发现动物有明显中毒症状与死亡;遗传毒性试验结果均为阴性。因此,葛姜复合饮品无毒无害、食用安全。

关键词:急性毒性;遗传毒性;葛姜复合饮品

中图分类号:  TS          文献标识码:  A                文章编号:  

The preliminary evaluation on toxicological of mixed gejiang drinks

       LI Sheng1, XIE mei-yu2,*, YU Shan3   

 (1. Jilin college of industry and commerce, Changchun 130507;  2.College of Chemistry and Life Science, Changchun University of Technology,Changchun 130012;3. KANGMEI pharmaceutical co.LDT Beijing 100000)   

 

Abstract: The mixed gejiang drinks was a functional food by protecting liver from lcohol damage which comprising kudzu,licorice,hovenia dulcis thunb, schisandra, turmeric, xylitol,P-hydroxy benzoic acid ethyl ester. Inorder to determine whether its cause harm to human health, the test studied the toxicological evaluationAccording to Health food inspection and evaluation of technical specifications Implementation Manual, the acute toxicity and genetic toxicity tests set on for mixed gejiang drinks, genetic toxicity including Amese test, micronucleus test and sperm abnormality test .The results showed that the rats in acute toxicity test had no death or obviousy toxic symptomsthe results of every dosage group in genetic toxicity  test were negative. The mixed gejiang drinks were Non-toxic.

Key words: acute toxicity tests; genetic toxicity tests; mixed gejiang drinks

 

酒精性肝损伤又称为酒精性肝病,是由于长期大量饮酒所致的肝脏疾病。初期通常表现为脂肪肝,进而可发展成酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化,严重酗酒时可诱发广泛肝细胞坏死甚或肝功能衰竭[1]。目前中医学者普遍认为其病因为过量饮酒,病理因素为湿热、痰浊、气滞、血瘀,病位在肝,与脾、胃、肾等脏腑关系密切。病机为痰湿蕴结、气血阻滞,影响肝之疏泄,日久

闭阻肝络诱发本病[2]。现代研究表明:大量乙醇进入机体后,在乙醇脱氢酶的催化下大量脱氢氧化,

使三羧酸循环产生障碍和脂肪酸氧化减弱而影响脂肪代谢。乙醇可致α-磷酸甘油增多而促进甘油三

酯合成,致使脂肪在肝细胞内沉积,同时乙醇能激活氧分子,产生氧自由基导致肝细胞膜的脂质过

 


 收稿日期:                      

作者简介:李生(1962—),籍贯(长春),学士,助理研究员。

通讯作者:谢美玉( 1991—),女,硕士研究生,研究方向为天然产物提取。

 

氧化及体内还原型谷胱甘肽的耗竭[3]。另外,乙醇代谢中可产生一些副产物,如NADH/NAD+增高,可影响正常糖代谢途径,产生氧自由基,引起肝细胞损伤,甚至肝细胞坏死、肝纤维化合肝硬化。

据调查:酒精性肝纤维化和肝硬化的5年存活率为50%,且有10%的肝硬化患者有可能演变为肝癌[4]。酒精中毒是社会常见疾病。据统计全世界有1500-2000万人酗酒。不仅是个人健康受损,而且也是社会和家庭问题,所以引起医学、心理学和社会各界的广泛重视[5]。我国嗜酒者虽然不及发达国家,但逐年上升,嗜酒者中酒精性肝病发病率为29.3%

保护肝脏健康已经是摆在我们面前的一个刻不容缓的任务,目前对酒精性肝损伤的治疗主要以戒酒、营养支持、保健干预为主,其他保肝药物不堪理想,特别是西药,未有突破性的进展,在国内市场,保肝中成药占主要市场份额对酒精性肝损伤有辅助保护作用的保健食品研发和应用迫在眉

睫。葛姜复合饮品是由葛根、姜黄、枳椇子、甘草、五味子辅以木糖醇和对羟基苯甲酸乙酯而研制的一款对酒精性肝损伤有辅助保护作用的保健食品。本研究根据《保健食品检验与评价技术规范实施手册》对该饮品进行急性毒性和遗传毒性试验,以评价葛姜复合饮品的食用安全性,为该产品的开发提供科学依据[6]

1        实验材料

1.1   料与试剂

环磷酰胺(0.2g/支)、吐温80、小牛血清(100mL/瓶)、秋水仙素(1g/瓶)、葛姜复合饮品的浓缩液(1:16

1.2仪器与设备

T1000型电子天平(d=0.1g)、日本产Olympus—CH显微镜

1.3实验动物

清洁级ICR雌、雄小白鼠

2   实验方法

2.1急性毒性试验

本试验采用霍恩氏法,将小鼠禁食16h(当日1630分至次日830分),不限制饮水,按体重要求选用小鼠20只,称重、染号,雌、雄各半。试验设20.0g/kg BW一个剂量,取50.0g受试物溶于蒸馏水至50mL容量瓶混匀定容,采用经口灌胃方式给予受试物,各剂量组灌胃量为0.2mL/10g BW。灌胃后观察14天,主要观察小鼠的中枢神经系统及躯体运动有无改变姿势、叫声异常、运动失调等;自主神经有无瞳孔放大或缩小、流涎、流泪等;呼吸系统有无流鼻涕、潮式呼吸等;胃肠系统有无气胀,腹泻或便秘等。并记录出现中毒症状的时间。如果动物有死亡,记录死亡数、死亡时间,对死亡动物做大体解剖,并在第14天称量体重,计算增重。

2.2微核试验

体重要求选用雌、雄小鼠各25只,称重、染号随机分为5个剂量组,每组10只,雌、雄各半。试验设10.05.0 2.5 g/kg BW三个剂量组,分别取25.0g 12.5g 6.3g受试物溶于蒸馏水至50mL容量瓶混匀定容,另设阴性对照组(蒸馏水)、阳性对照组(环磷酰胺40mg/kg BW:取200 mg环磷酰胺加入生理盐水至10mL充分混匀稀释10倍),采用间隔24h两次经口灌胃法进行试验,各组每次灌胃量为0.2mL/10g BW。于第二次灌胃后6h,颈椎脱臼处死小鼠,取股骨以小牛血清稀释涂片,甲醇固定,Giemsa染色。在光学显微镜下,每只动物计数1000个嗜多染红细胞(PCE),微核发生率以含微核的嗜多染红细胞(PCE)千分率计,每只动物记数200个嗜多染红细胞(PCE),计算嗜多染红细胞(PCE)与成熟红细胞(RBC)比值,并进行统计分析。

2.3精子畸形试验

按体重要求选用雄性小鼠25只,称重、染号随机分为5个剂量组,每组5只。试验设10.05.0 2.5 g/kg BW三个剂量组,分别取25.0g12.5g 6.3g 受试物溶于蒸馏水至50mL容量瓶混匀定容,另设阴性对照组(蒸馏水)、阳性对照组(环磷酰胺40mg/kg BW:取200mg环磷酰胺加入生理盐水至10mL充分混匀,稀释10倍)。采用经口灌胃方式给予受试物,每日灌胃一次,连续5d。各组每次灌胃量为0.2mL/10g BW。末次灌胃后第30d处死小鼠,取附睾制片,伊红染色,每组计数5只动物,每只动物计数1000个结构完整的精子,计算畸变精子发生率,并进行统计分析。

2.4. Ames试验:

2.4.1测试菌株:采用四株鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97TA98TA100TA102。为本实验室鉴定、冻存,生物学性状符合菌株要求。测试菌液浓度每毫升不少于1×109活菌数。

2.4.2 S9活性鉴定:采用多氯联苯(PCB)诱导的大鼠肝匀浆作为体外代谢活化系统。S9制成后,经无菌检查,测定蛋白含量(Lowry法),每毫升蛋白含量不超过40mg为宜,并经间接致癌物(1,8-二羟基蒽醌50.0μg /皿及二氨基芴10.0μg /皿)鉴定其生物活性合格后储存于深低温或冰冻干燥,保存期不超过一年。    

2.4.3阳性对照:非活化系统TA97TA98TA102为敌克松50.0μg /皿,TA100为叠氮钠1.5μg /皿。活化系统TA97TA98TA100采用二氨基芴10.0μg /皿,TA10218-二羟基蒽醌50.0μg /皿。

 2.4.4测定方法:试验设50001000200408μg/5个受试物剂量,取2.5g受试物加蒸馏水至50mL混均即为5000μg/皿剂量,其余各受试物剂量1/5倍比递减稀释;上述受试液经灭菌(时间20min,温度:121,压力:0.103Mpa)后使用;另设未处理对照、溶剂对照(空白对照液)、阳性对照。在顶层琼脂中加入0.1mL试验菌株增菌液、0.1mL受试物溶液,代谢活化时加入0.5mL S9混合液,混匀后倒入底层培养基平板上。在37培养48h,计数每皿回变菌落数。如果受试物的回变菌落数是自发回变菌落数2倍以上,并具有剂量--反应关系者则定为阳性。每个剂量做三个平行。整套试验在相同条件下重复做两次并分别统计。

 

3   结果与分析

3.1急性毒性试验结果

3-1为急性毒性实验结果,结果显示:试验期间各组动物,未见中毒症状、死亡数为零,雌、雄小鼠LD5020.0g/kg BW。按照我国《化合物经口急性毒性分级标准》中的毒性6类分级标准分级,葛姜复合饮品属实际无毒型。

 

 

 

 

 

 

3-1 小鼠急性毒性试验结果

剂量组(g/kgBW

性别

数量(只)

始重(g

终重(g

增重(g

死亡只数()

死亡率(%)

20.0

雄性

10

20.7±0.4

32.1±1.4

11.3±1.3

0

0

20.0

雌性

10

19.9±0.6

29.3±1.8

9.4±1.3

0

0

3.2微核试验结果

微核试验结果表明:由表3-2中的数据经过经卡方检验,与对照组比较,阳性对照组微核率有高度显著性差异(P0.01),各剂量组微核率与对照组无显著性差异(P0.05);经方差分析,各组动物PCE/RBC值无显著性差异(P0.05)。由此可知该样品骨髓细胞微核试验结果为阴性,各组动物未见细胞毒性作用,说明葛姜复合饮品对骨髓微核细胞没有诱导作用。

3-2 微核试验结果

性别

组别

动物数

检查PCE

PCE/RBC

含微核PCE

微核率

g/kgBW

(只)

(个)

 

(个)

%

10.0

5

5×1000

0.93±0.11

5

1.0±0.0

5.0

5

5×1000

0.95±0.11

7

1.4±0.9

2.5

5

5×1000

0.94±0.10

9

1.8±0.4

对照组

5

5×1000

0.93±0.10

6

1.2±0.4

阳性对照组

5

5×1000

0.91±0.09

119

23.8±4.8**

10.0

5

5×1000

0.95±0.12

8

1.6±0.5

5.0

5

5×1000

0.94±0.10

6

1.2±0.4

2.5

5

5×1000

0.92±0.10

5

1.0±0.0

对照组

5

5×1000

0.91±0.10

9

1.8±0.8

阳性对照组

5

5×1000

0.90±0.09

103

20.6±3.8**

注:**与对照组比较有显著性差异(P0.01

3.3精子畸形试验结果

精子试验结果表明:由表3-3中的数据经Wilconson秩和检验,与阴性对照组比较,阳性对照组精子畸形率差异具有显著性(P0.01),各剂量组精子畸形率与阴性对照组比较无显著性差异(P0.05),说明该样品精子畸形试验结果为阴性,葛姜复合饮品在剂量下不能够引起精子发生畸形。

 

 

 

 

 

 

 

3-3 精子畸形试验结果

组别

动物数

观察精子数

精子畸形类型

畸形精子数

畸形率

g/kgBW

(只)

(个)

无定型

无钩

胖头

香蕉头

双头

双尾

尾折叠

其他

(个)

%

10.0

5

5×1000

29

25

26

27

0

0

0

0

107

21.4±2.1

5.0

5

5×1000

27

24

23

29

1

0

0

0

104

20.8±1.5

2.5

5

5×1000

25

23

24

28

1

0

0

0

101

20.2±2.2

对照组

5

5×1000

30

26

26

28

1

1

0

0

112

22.4±2.6

阳性对照组

5

5×1000

99

91

88

94

12

10

5

7

406

81.2±3.8**

注:**与对照组比较有显著性差异(P0.01

3.4Ames试验结果

3-53-6为葛姜复合饮品的两次Amese试验结果,两次实验结果表明,葛姜复合饮品的Amese试验结果为阴性。

3-5 葛姜复合饮品Amese第一次试验

 

 

μg/皿)

T A 97

T A 98

T A 100

T A 102

-S9                             +S9

-S9                            +S9

-S9                        +S9

-S9                     +S9

5000

116.3±11.1

113.3±6.8

37.3±4.7

35.3±2.5

153.7±6.7

160.3±11.8

272.0±7.0

273.3±11.5

1000

123.0±7.0

117.7±9.0

35.0±2.0

33.3±3.2

162.0±14.9

155.7±12.9

273.0±10.1

282.3±9.3

200

119.3±13.9

120.7±10.2

34.7±3.8

34.3±2.9

154.7±10.7

158.3±8.7

274.3±16.3

269.0±10.6

40

116.3±7.6

116.3±5.7

34.0±4.6

33.7±4.0

167.7±6.0

165.7±7.1

280.7±10.8

264.7±8.1

8

121.7±8.0

120.3±9.3

32.0±3.0

34.7±3.5

159.7±11.9

167.0±6.6

275.0±7.5

275.0±6.1

对照组

118.0±5.3

115.0±8.2

31.3±2.1

32.3±3.2

159.7±4.0

161.0±12.3

267.0±8.5

271.3±10.3

溶剂对照

114.7±7.5

121.3±4.0

33.0±3.6

38.0±3.6

159.0±10.1

157.3±6.7

284.3±7.1

275.7±7.5

阳性对照

1381.7±32.3

1346.7±51.1

1923.7±67.3

1970.3±73.4

1064.0±64.4

1175.7±56.1

1086.3±63.6

996.3±38.1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3-6 葛姜复合饮品Amese第二次试验

 

μg/皿)

T A 97

T A 98

T A 100

T A 102

-S9                        +S9

-S9                             +S9

-S9                   +S9

-S9                   +S9

5000

117.3±7.5

123.3±10.8

35.0±1.7

36.3±3.5

166.0±10.8

158.3±10.0

274.3±15.3

271.0±12.5

1000

112.0±4.0

116.3±12.7

33.3±4.0

32.0±2.6

167.3±7.6

167.0±10.0

272.3±9.0

269.3±12.7

200

119.0±6.2

115.7±4.5

31.0±3.6

34.0±3.6

162.0±11.5

153.7±6.7

270.7±9.3

272.3±6.5

40

118.0±10.4

120.7±11.8

33.7±3.5

38.0±2.6

157.3±8.5

160.0±8.7

274.7±13.6

282.3±9.0

8

113.3±5.9

117.7±4.0

35.0±2.6

32.0±2.6

158.3±8.1

167.7±6.7

274.0±9.2

277.7±5.0

对照组

117.7±7.1

120.3±5.5

34.7±4.0

35.0±3.6

163.0±7.8

155.7±8.5

281.7±9.6

279.0±13.5

溶剂对照

119.3±8.5

110.3±7.5

34.7±4.2

35.7±2.5

156.7±13.4

162.7±11.4

275.0±8.2

282.3±11.0

阳性对照

1395.3±80.3

1309.0±96.0

1939.0±65.1

1907.6±55.1

1235.6±86.6

1287.0±51.4

1253.3±35.8

1031.0±46.7

 

4    结论

葛根、甘草、枳椇子为卫生部关于进一步规范保健食品原料管理通知(卫法监发[2002]51号)中药食两用所列的品种,姜黄、五味子为只能用于保健食品的品种,国内对这些原料的安全性有大量的文献报道,本方原料合理无配伍禁忌,但对本方的安全性未见报道。本试验根据《保健食品检验与评价技术规范实施手册》对其进行初步毒理学评价,为企业保健食品申报及技术审评提供科学依据。为了解受试物的毒性强度、性质、可能的靶器官以及其遗传和致突变的性质而进行急性毒性和遗传毒性试验。根据急性毒性分级标准判定,其安全性分级属于实际无毒级别。遗传毒性试验结果表明:在试验剂量范围内,葛姜复合饮品不会引起各试验菌株的突变,不会引起小鼠骨髓微核突变,对小鼠生殖细胞没有毒性作用。因此,葛姜复合饮品无毒无害、服用安全。

参考文献:

[1]酒精性肝病诊疗指南[J]. 中华肝脏病杂志,2006,03:164-166.

 [2] 梁浩卫,赵文霞. 中医药治疗酒精性脂肪肝的研究进展[J].中医临床研究,2013,07:121-122.

 [3] 陈雪龙. 实验性肝损伤动物模型的研究进展[J].实验动物科学,2008,03:47-48+59.

 [4] 赵益梅. 酒精性肝病的中医文献及基础实验研究[D].山东中医药大学,2005.143

 [5] 何睦,姚卫峰,蔡秀江,丁安伟,蒋叶娟. 代谢组学在肝肾损伤研究中的应用[J].中国临床药理学与治疗学,2012,08:924-930.

[6] 中华人民共和国卫生部. 保健食品检验与评价技术规范实施手册[M]. 2003.177-203

 

作者:李生,谢美玉,*,于珊 来源:中国食品医药产业研究院
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